晶體-細(xì)胞互相功效的蛋白質(zhì)組學(xué)：腎結(jié)石研發(fā)的模型

Thongboonkerd V. Proteomics of Crystal-Cell Interactions: A Model for Kidney Stone Research. Cells. 2019 Sep 12;8(9):1076. doi: 10.3390/cells8091076. PMID: 31547429; PMCID: PMC6769877.

晶體-細(xì)胞互相功效的蛋白質(zhì)組學(xué)：腎結(jié)石研發(fā)的模型

腎結(jié)石/尿石癥（即腎結(jié)石病）仍舊是1個(gè)世界公共衛(wèi)生問(wèn)題，發(fā)病率/抱病率不停升高。腎結(jié)石最常見(jiàn)的化學(xué)成份是草酸鈣，它通過(guò)結(jié)晶、晶體生長(zhǎng)、晶體集結(jié)、晶體細(xì)胞粘擁護(hù)通過(guò)腎間質(zhì)中的細(xì)胞外基質(zhì)侵入來(lái)激發(fā)結(jié)石生成。在這類(lèi)流程中，晶體 - 細(xì)胞互相功效（定論為“細(xì)胞通過(guò)粘附在細(xì)胞外表或內(nèi)化到細(xì)胞中的晶體的任意方法的牽連而變化細(xì)胞的情況，隨同著晶體的改變，比如，細(xì)胞誘導(dǎo)的生長(zhǎng)，粘合本領(lǐng)，降解等”）針對(duì)晶體在腎臟中的保留十分首要。在過(guò)去的12年中，蛋白質(zhì)組學(xué)已全面運(yùn)用于腎結(jié)石研發(fā)，旨在更好地了解腎結(jié)石生成的致病體制。本文概括了該行業(yè)的當(dāng)下常識(shí)，并總結(jié)了從一切將蛋白質(zhì)組學(xué)運(yùn)用于晶體 - 細(xì)胞互相功效研發(fā)的研發(fā)中獲取的信息，這類(lèi)研發(fā)隨后造成了性能研發(fā)，以處理表示蛋白質(zhì)組學(xué)信息在腎結(jié)石重病發(fā)病體制中的顯著牽連或性能功效。

1. 引言

腎結(jié)石病仍舊是一類(lèi)常見(jiàn)的人類(lèi)重病，在世界發(fā)達(dá)國(guó)度和成長(zhǎng)中國(guó)度都能夠搜到[1，2，3]。腎結(jié)石首要由含鈣晶體構(gòu)成，特別是草酸鈣（CaOx）一水合物（COM）和二水合鈣（COD）[1，2，3]。腎結(jié)石生成的體制流程相當(dāng)高難，牽扯結(jié)晶、晶體生長(zhǎng)、晶體集結(jié)、晶體細(xì)胞粘附并且通過(guò)腎間質(zhì)中的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）侵入晶體[4，5，6]。結(jié)晶既能夠在腎小管內(nèi)（管內(nèi)模型）內(nèi)產(chǎn)生，也能夠產(chǎn)生在腎間質(zhì)（蘭德?tīng)柊邏K模型）[4，5，6]。晶體生成后，單個(gè)晶體通過(guò)晶體生長(zhǎng)或集結(jié)體制變成較大的顆粒[7，8]。另外，晶體-細(xì)胞粘附造成晶體潴留到腎小管或間質(zhì)內(nèi)[9，10]。粘附的晶體能夠內(nèi)化到腎小管細(xì)胞中進(jìn)行降解，反之亦然，通過(guò)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)結(jié)石生成流程[11，12]。最終，在腎間質(zhì)中生成的內(nèi)化晶體能夠應(yīng)用纖溶酶-纖溶酶原途徑[13]通過(guò)ECM侵入或遷移到其余部位，隨后激發(fā)組織炎癥和腐蝕[14，15]。

有趣的是，晶體保留和結(jié)石生成的要害流程之一是晶體 - 細(xì)胞粘附方法，須要“晶體 - 細(xì)胞互相功效”，這能夠在這里定論為細(xì)胞被粘附在細(xì)胞外表或內(nèi)化到細(xì)胞中的晶體的任意牽連而變化的情況， 隨同著晶體的改變，比如，細(xì)胞誘導(dǎo)的生長(zhǎng)、粘合本領(lǐng)、降解等。應(yīng)用術(shù)語(yǔ)“互相功效”是通過(guò)晶體和細(xì)胞之間的“互相功效”來(lái)邏輯的。很顯著，晶體能夠引發(fā)細(xì)胞中的不少改變，從輕度到重度細(xì)胞毒性[14，15，16]。另一方面，細(xì)胞的構(gòu)成，特別是在頂端外表和內(nèi)吞囊泡中，會(huì)牽連晶體的生長(zhǎng)，粘合本領(lǐng)和降解[17，18]。這類(lèi)互相功效能夠加強(qiáng)腎內(nèi)晶體的保留和晶體加入腎小管細(xì)胞的內(nèi)吞功效。另外，晶體-細(xì)胞互相功效也可造成腎小管細(xì)胞傷害和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而進(jìn)一步加強(qiáng)結(jié)石生成流程[14，15，16]。

在蛋白質(zhì)組學(xué)世紀(jì)，蛋白質(zhì)組學(xué)已被全面運(yùn)用于各類(lèi)腎臟重病[19，20，21]。在過(guò)去的12年中，蛋白質(zhì)組學(xué)已全面運(yùn)用于腎結(jié)石重?。ㄌ貏e是COM和COD型號(hào)）的研發(fā)，旨在更好地了解腎結(jié)石生成的致病體制[22，23]。本文總結(jié)了一切將蛋白質(zhì)組學(xué)運(yùn)用于晶體 - 細(xì)胞互相功效研發(fā)的研發(fā)，這類(lèi)研發(fā)隨后造成了性能研發(fā)，以處理表示蛋白質(zhì)組學(xué)信息在腎結(jié)石重病發(fā)病體制中的顯著牽連或性能功效。請(qǐng)注重，這類(lèi)研發(fā)運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)從結(jié)石生成者中判定尿液或腎結(jié)石基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，而沒(méi)有任意證據(jù)標(biāo)明“晶體 - 細(xì)胞互相功效”（見(jiàn)上面的定論），被消除在本評(píng)估之外（由于此中不少蛋白質(zhì)不過(guò)與尿液中的結(jié)石調(diào)整劑混合，或者不過(guò)在結(jié)石腫大時(shí)期通過(guò)窒礙卡在結(jié)石基質(zhì)內(nèi)，但在結(jié)石發(fā)病體制中沒(méi)有任意功效）。腎結(jié)石研發(fā)中與CaOx晶體 - 細(xì)胞互相功效的蛋白質(zhì)組學(xué)有關(guān)的一切有關(guān)研發(fā)總結(jié)在表 1并研討如下。

表 1 與CaOx晶體 - 細(xì)胞互相功效的蛋白質(zhì)組學(xué)有關(guān)的一切有關(guān)研發(fā)摘要。年作家/考慮文獻(xiàn)晶體-細(xì)胞互相功效的前提蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)/性能探測(cè)首要發(fā)掘不同劑量和型號(hào)的CaOx晶體對(duì)腎小管細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的牽連2008塞曼戈恩等 [24]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞 （全細(xì)胞）晶體：100 μg/mL COM養(yǎng)成：48 小時(shí)2-DE，西普羅紅寶石染色，Q-TOF 質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜11種上浮和5種下調(diào)蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)錄/翻譯，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)，核和細(xì)胞構(gòu)造，運(yùn)輸，應(yīng)激反應(yīng)和生物合成中闡揚(yáng)功效。2008通布克德五世等 [25]]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞）晶體：1000 μg/mL COM 孵育：48 小時(shí)2-DE，西普羅紅寶石染色，Q-TOF 質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜判定出25種上浮和23種下調(diào)蛋白質(zhì)。當(dāng)伴侶被上浮時(shí)，參加蛋白質(zhì)合成，細(xì)胞周期調(diào)整，細(xì)胞構(gòu)造和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的其余蛋白質(zhì)被下調(diào)。2008塞曼戈恩T等[26]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞）晶體：100 μg/mL COD孵育：48 小時(shí)2-DE，西普羅紅寶石染色，Q-TOF 質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜5種上浮和5種下調(diào)蛋白質(zhì)，操控細(xì)胞代謝，構(gòu)造，完好性，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和應(yīng)激反應(yīng)。2010陳 S 等 [27]]細(xì)胞：HK-2 細(xì)胞 （全細(xì)胞）晶體：200 μg/mL COM養(yǎng)成：12 小時(shí)2-DE 銀二胺染色， LC-靜電放電微粒/微粒9種上浮和3種下調(diào)蛋白質(zhì)，在能量構(gòu)成，細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡，應(yīng)激反應(yīng)，鈣平衡和蛋白質(zhì)合成中起功效。2011蔣宗華等 [28]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞）晶體：100 μg/mL COD孵育：48 小時(shí)2-DE、Pro-Q 祖母綠糖蛋白染色、西普羅紅寶石總蛋白染色、Q-TOF 質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜在16種明顯變化的糖蛋白中，3個(gè)蛋白酶體亞基的糖型上浮，而肌動(dòng)蛋白有關(guān)蛋白3（ARP3）的糖型下調(diào)。2012柴亞里特 S 等 [29]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（純化的線(xiàn)粒體）晶體：100微克/毫升COM孵育：48小時(shí)2-DE，深紫色染色，Q-TOF 質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜，氧合分印跡測(cè)定12種上浮和3種下調(diào)線(xiàn)粒體蛋白，調(diào)整細(xì)胞構(gòu)造，新陳代謝和能量構(gòu)成。COM晶體還誘導(dǎo)線(xiàn)粒體性能阻礙和氧化潤(rùn)飾蛋白在細(xì)胞中的沉淀。2017維奈法特A等 [30]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞 （全細(xì)胞）晶體：100/1000 μg/mL COD/COM養(yǎng)成：48 小時(shí)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互相功效網(wǎng)絡(luò)解析，熒光素 - 熒光素酶ATP測(cè)定，氧化印跡測(cè)定，泛素化蛋白質(zhì)的丈量，細(xì)胞滅亡測(cè)定和晶體 - 細(xì)胞粘附測(cè)定與低劑量相比，高劑量的這類(lèi)晶體引發(fā)細(xì)胞蛋白質(zhì)組更顯著的改變，以及COM比COD更有效地誘導(dǎo)細(xì)胞蛋白質(zhì)組的變化。用高劑量解決的細(xì)胞擁有更高程度的細(xì)胞內(nèi)ATP，氧化潤(rùn)飾蛋白和細(xì)胞滅亡，但泛素化蛋白程度過(guò)低。COM也誘發(fā)比COD更嚴(yán)重的細(xì)胞毒性。用抗氧化劑EGCG對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)解決能夠減低晶體誘導(dǎo)的氧化潤(rùn)飾蛋白的沉淀和細(xì)胞的晶體結(jié)合本領(lǐng)。2018皮拉彭 P 等 [31]]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞）晶體：1000 μg/mL COM 孵育：48 小時(shí)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互相功效網(wǎng)絡(luò)解析、增殖測(cè)定、傷口愈合測(cè)定、氧化印跡測(cè)定、熒光素-熒光素酶 ATP 測(cè)定和經(jīng)上皮耐藥性 （TER） 丈量用1000μg/ mL COM晶體解決的細(xì)胞毒性細(xì)胞在細(xì)胞增殖，傷口愈合本領(lǐng)，TER并且慎密連通蛋白zonula閉塞-1（ZO-1）和信號(hào)蛋白R(shí)hoA的程度方面存在減低。相同，細(xì)胞內(nèi)ATP和氧化潤(rùn)飾蛋白的程度上升。腎小管細(xì)胞頂端外表COM晶體受體的蛋白質(zhì)組判定2011方恩根等 [32]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞 （純化的頂端膜）晶體：COM孵育：過(guò)夜甲基纖維素/質(zhì)譜、Q-TOF 質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜、晶體細(xì)胞粘附測(cè)定、抗體中和測(cè)定共判定出96個(gè)潛在的COM晶體受體。膜聯(lián)蛋白II成為COM晶體受體的功效通過(guò)應(yīng)用特同性抗體的中和測(cè)定獲得證明。2012舒替蓬坦酸 S 等 [33]]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞和純化的頂膜）晶體：100μg/mL COM孵育：30分鐘，72小時(shí)2-DE、西普魯比紅寶石染色、Q-TOF 質(zhì)譜和質(zhì)譜解析、晶體-細(xì)胞粘附測(cè)定、鈣誘導(dǎo)測(cè)定、抗體中和測(cè)定膜聯(lián)蛋白A1成為COM晶體受體。2013坎拉亞 R 等 [34]]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞和純化的頂膜）晶體：100μg/mL COM養(yǎng)成：30分鐘，72小時(shí)2-DE、西普羅紅寶石染色、Q-TOF 質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜、晶體細(xì)胞粘附測(cè)定、草酸鹽誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)、抗體中和測(cè)定A-烯醇化酶成為COM晶體受體。2016皮拉彭 P 等 [35]]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞和純化的頂膜）晶體：100μg/mL COM孵育：30分鐘晶體-細(xì)胞粘附測(cè)定、鈣誘導(dǎo)測(cè)定膜聯(lián)蛋白A1成為COM晶體受體。2016方恩根等 [36]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全部細(xì)胞和純化的頂膜）晶體：100μg/mL COM孵育：1小時(shí)晶體細(xì)胞粘附測(cè)定、抗體中和測(cè)定A-烯醇化酶成為COM晶體受體。2016方恩根等 [37]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞和純化的頂膜）晶體：100μg/mL COM養(yǎng)成：1小時(shí)，48小時(shí)晶體-細(xì)胞粘附測(cè)定、晶體內(nèi)化測(cè)定、抗體中和測(cè)定、小煩擾RNA（siRNA）敲低蛋白質(zhì)HSP90用作COM晶體受體。2016馬尼索恩 J 等 [38]]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞和純化的頂膜）晶體：100μg/mL COM孵育：30分鐘晶體-細(xì)胞粘附測(cè)定、蛋白質(zhì)過(guò)表示、草酸鹽誘導(dǎo)測(cè)定A-微管蛋白過(guò)表示造成三類(lèi)COM晶體受體的下調(diào)，含蓋α烯醇化酶，HSP70和HSP90，并減低了細(xì)胞的晶體結(jié)合本領(lǐng)。2016彭薩庫(kù)爾 N 等 [39]]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全細(xì)胞）晶體：100 μg/mL COM孵育：30 分鐘晶體-細(xì)胞粘附測(cè)定、siRNA 蛋白質(zhì)敲低、草酸鹽誘導(dǎo)測(cè)定層粘連蛋白A / C敲低造成四種COM晶體受體的程度減低，含蓋維生素A，α烯醇化酶，S100和膜聯(lián)蛋白A2，以及細(xì)胞的晶體結(jié)合本領(lǐng)下落。2018馬尼索恩 J 等 [40]]細(xì)胞：HEK293T 細(xì)胞 （全細(xì)胞）晶體：100 μg/mL COM養(yǎng)成：1 小時(shí)晶體-細(xì)胞粘附測(cè)定，通過(guò)siRNA敲低蛋白質(zhì)HSP90用作COM晶體受體。2018維奈法特A等 [41]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（全部細(xì)胞和純化的頂膜）晶體：100μg/mL COM孵育：1小時(shí)晶體-細(xì)胞粘附測(cè)定、晶體內(nèi)化測(cè)定、抗體中和測(cè)定PMCA2用作COM晶體受體。COM晶體對(duì)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的牽連2010辛格托N等[42]細(xì)胞：U937 細(xì)胞 （全細(xì)胞）晶體：100 μg/mL COM養(yǎng)成：24 小時(shí)2-DE，深紫色染色，Q-TOF 質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜9種上浮蛋白質(zhì)和13種下調(diào)蛋白質(zhì)，在細(xì)胞周期，細(xì)胞構(gòu)造，碳水化合物代謝，脂質(zhì)代謝，mRNA加工并且蛋白質(zhì)合成，安穩(wěn)和降解中起功效。2013辛格托N等[43]]細(xì)胞：人巨噬細(xì)胞（全細(xì)胞）晶體：100μg/mL COM孵育：24小時(shí)2-DE，深紫色染色，Q-TOF 質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜，吞噬功效測(cè)定，通過(guò) SIRNA 敲低蛋白質(zhì)7種上浮和7種下調(diào)蛋白質(zhì)，操控細(xì)胞構(gòu)造，碳水化合物代謝，DNA / RNA加工，蛋白質(zhì)代謝，分子運(yùn)輸和應(yīng)激反應(yīng)。HSP90在巨噬細(xì)胞的吞噬體生成和吞噬活性中起著至關(guān)首要的功效。COM晶體對(duì)排泄組和外泌體蛋白質(zhì)組的牽連2016蔣宗華等 [13]細(xì)胞：MDCK細(xì)胞（排泄組）晶體：100 μg/mL COM養(yǎng)成：20 小時(shí)2-DE，深紫色染色，Q-TOF MS / MS，晶體遷移測(cè)定，細(xì)胞遷移測(cè)定COM晶體誘導(dǎo)2個(gè)來(lái)自腎小管細(xì)胞的排泄蛋白加大和4個(gè)減小。排泄性烯醇化酶-1的加大反過(guò)來(lái)又通過(guò)ECM加強(qiáng)了COM晶體的侵入。2016辛提普倫格拉特 K 等 [44]]細(xì)胞：U937 細(xì)胞（排泄組）晶體：100 μg/mL COM孵育：16 小時(shí)2-DE，深紫色染色，Q-TOF 質(zhì)譜和質(zhì)譜/質(zhì)譜COM晶體誘導(dǎo)了14個(gè)與U937單核細(xì)胞免疫反應(yīng)和細(xì)胞存活有關(guān)的排泄蛋白加大和4個(gè)減小。加大的HSP90限于于細(xì)胞外表。2018辛格托N等[45]細(xì)胞：人巨噬細(xì)胞（外泌體）晶體：100 μg/mL COM孵育：24小時(shí)2-DE，深紫色染色，納米LC-ESI-ETD MS / MS，細(xì)胞遷移測(cè)定，吞噬功效測(cè)定，通過(guò)siRNA敲低蛋白質(zhì)2種上浮和4種下調(diào)外泌體蛋白。來(lái)自晶體互相功效的巨噬細(xì)胞的外泌體誘導(dǎo)單核細(xì)胞的遷移/活化和巨噬細(xì)胞的吞噬活性。siRNA敲低了維生素素，順利地抑止了來(lái)自COM晶體表露巨噬細(xì)胞的外泌體的這類(lèi)功效。2018辛格托N等[46]細(xì)胞：人巨噬細(xì)胞（外泌體）晶體：100 μg/mL COM孵育：24小時(shí)納米LC-ESI-Qq-TOF，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，晶體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，晶體遷移實(shí)驗(yàn)7種上浮和19種下調(diào)外泌體蛋白。來(lái)自晶體互相功效巨噬細(xì)胞的外泌體誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移，加強(qiáng)腎小管細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子IL-8的構(gòu)成，與COM晶體擁有更大的結(jié)合本領(lǐng)，并通過(guò)ECM激活晶體入侵。

2. 不同劑量和型號(hào)的CaOx晶體對(duì)腎小管細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的牽連

運(yùn)用于晶體 - 細(xì)胞互相功效的蛋白質(zhì)組學(xué)的初次研發(fā)是在2008年完結(jié)的[24]。在這項(xiàng)工作中，認(rèn)真創(chuàng)建了研發(fā)模型，標(biāo)明劑量為100μg/ mL（每體積養(yǎng)成基）的COM晶體在48小時(shí)的埋伏期不會(huì)對(duì)腎小管細(xì)胞導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞毒性，以及細(xì)胞滅亡百分比不會(huì)加大。因而，由COM晶體誘導(dǎo)的細(xì)胞蛋白質(zhì)組的改變反映了細(xì)胞對(duì)COM晶體的反應(yīng)，而不是它們的細(xì)胞毒性功效。另外，掃描電子顯微鏡（SEM）在與細(xì)胞孵育后顯現(xiàn)出COM晶體邊緣的變形，初次標(biāo)明晶體 - 細(xì)胞互相功效擁有直接的試驗(yàn)證據(jù)。應(yīng)用二維凝膠電泳（2-DE）與Sypro Ruby熒光染色，接著進(jìn)行四極桿飛翔時(shí)間（Q-TOF）質(zhì)譜（MS）和串聯(lián)MS（MS / MS），判定了11種上浮和5種下調(diào)蛋白質(zhì)，它們?cè)谵D(zhuǎn)錄/翻譯，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)，核和細(xì)胞構(gòu)造，運(yùn)輸，應(yīng)激反應(yīng)和生物合成中起功效。此中許多蛋白質(zhì)組學(xué)信息通過(guò)二維（2-D）蛋白質(zhì)印跡獲得證明[24]。

隨后，進(jìn)行了一項(xiàng)亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組研發(fā)[29]，以評(píng)價(jià)100μg/mL COM晶體對(duì)線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)組的牽連并且應(yīng)用高度純化的線(xiàn)粒體分離方式表露于晶體48小時(shí)的腎小管細(xì)胞的性能[47]。應(yīng)用2-DE與深紫色熒光染色的較為解析，接著是Q-TOF MS和MS / MS解析，確認(rèn)了12種上浮和3種下調(diào)線(xiàn)粒體蛋白，它們調(diào)整細(xì)胞構(gòu)造，代謝和能量構(gòu)成。另外，Oxyblot探測(cè)標(biāo)明，COM晶體誘導(dǎo)線(xiàn)粒體性能阻礙和氧化潤(rùn)飾蛋白在細(xì)胞中的沉淀[29]。

另一項(xiàng)應(yīng)用很高劑量（200 μg/mL）COM晶體的研發(fā)顯現(xiàn)，當(dāng)腎小管細(xì)胞與COM晶體和2 mM草酸鹽一塊孵育較短時(shí)間（僅12小時(shí)）時(shí)，細(xì)胞滅亡不會(huì)加大[27]。應(yīng)用2-DE銀染色，接著液相色譜法結(jié)合電噴霧電離MS / MS（LC-ESI MS / MS），信息顯現(xiàn)9種上浮和3種下調(diào)細(xì)胞蛋白，其功效于能量構(gòu)成，細(xì)胞增殖，凋亡，應(yīng)激反應(yīng)，鈣平衡和蛋白質(zhì)合成。

應(yīng)用高得多劑量（1000 μg/mL）的COM晶體，細(xì)胞在與晶體孵育48小時(shí)后，細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重細(xì)胞毒性，總細(xì)胞滅亡加大[25]。應(yīng)用2-DE與西普羅紅寶石染色，接著進(jìn)行Q-TOF MS和MS / MS解析，判定出25種上浮和23種下調(diào)蛋白。EZRIN、烯醇化酶-1和膜聯(lián)蛋白-A1程度的減低通過(guò)2-D蛋白質(zhì)印跡獲得證明。有趣的是，伴侶被上浮，而其余參加蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞構(gòu)造和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白質(zhì)被下調(diào)[25]。較近應(yīng)用各類(lèi)測(cè)定方式進(jìn)行了性能研發(fā)，以確認(rèn)該表示蛋白質(zhì)組學(xué)信息集的生物學(xué)有關(guān)性[31]。最初，一切顯著變化的蛋白質(zhì)被提交達(dá)STRING生物數(shù)據(jù)學(xué)工具[48]以獲取蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)互相功效網(wǎng)絡(luò)，其揭露了細(xì)胞增殖/傷口愈合，氧化應(yīng)激/線(xiàn)粒體性能并且細(xì)胞連通復(fù)合物/完好性是顯著變化蛋白質(zhì)的首要生物學(xué)性能。驗(yàn)證明驗(yàn)標(biāo)明，用1000 μg/mL COM晶體解決的細(xì)胞毒性腎小管細(xì)胞在細(xì)胞增殖、傷口愈合本領(lǐng)、經(jīng)上皮阻力（TER）并且閉塞-1（ZO-1）和信號(hào)蛋白R(shí)hoA的慎密連通蛋白程度方面均有所下落。相同，氧化潤(rùn)飾蛋白的程度上升。固然ATP合酶α亞基前體減小，但參加能量構(gòu)成和穩(wěn)態(tài)的其余線(xiàn)粒體蛋白（比如烏頭酶、腺苷酸激酶2、泛醇-細(xì)胞色素-c復(fù)原酶）加大[25]。結(jié)果，COM解決的細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)ATP程度上升[31]。這類(lèi)信息也許反映了COM晶體誘導(dǎo)的微管毒性時(shí)期產(chǎn)生的細(xì)胞流程[31]。

蛋白質(zhì)組學(xué)還運(yùn)用于研發(fā)表露于無(wú)毒劑量（100μg/mL）的COD晶體48小時(shí)后腎小管細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的改變[26]。應(yīng)用2-DE和Sypro Ruby染色，接著進(jìn)行Q-TOF MS和MS/MS解析，信息顯現(xiàn)5種上浮和5種下調(diào)蛋白質(zhì)操控細(xì)胞代謝、構(gòu)造、完好性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和應(yīng)激反應(yīng)[26]。隨后，研發(fā)了100 μg/mL COD晶體誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞糖蛋白組的改變[28]。應(yīng)用2-DE和Pro-Q祖母綠糖蛋白染色，接著應(yīng)用Sypro Ruby總蛋白染色進(jìn)行歸一化，Q-TOF MS和MS / MS判定了16個(gè)顯著變化的糖蛋白，含蓋負(fù)擔(dān)調(diào)整細(xì)胞 - 細(xì)胞解離的3個(gè)蛋白酶體亞基的糖型和在細(xì)胞完好性中起功效的肌動(dòng)蛋白有關(guān)蛋白3（ARP3）。這類(lèi)信息標(biāo)明，COD晶體造成細(xì)胞解離并減低細(xì)胞完好性[28]。

另外，還對(duì)表露于不同劑量和型號(hào)的CaOx晶體后腎小管細(xì)胞的性能擾動(dòng)進(jìn)行了較為解析[30]。表示信息的較為標(biāo)明，與低劑量相比，這類(lèi)晶體的高劑量引發(fā)細(xì)胞蛋白質(zhì)組更顯著的改變，以及COM比COD更有效地誘導(dǎo)細(xì)胞蛋白質(zhì)組的變化。性能解析顯現(xiàn)，在用高劑量COM和COD解決的細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)ATP，氧化潤(rùn)飾蛋白和細(xì)胞滅亡程度很高，但泛素化蛋白程度過(guò)低。COM晶體也誘導(dǎo)比COD更嚴(yán)重的細(xì)胞毒性。用抗氧化劑表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)解決能夠減低晶體誘導(dǎo)的氧化潤(rùn)飾蛋白的沉淀和細(xì)胞的晶體結(jié)合本領(lǐng)。這類(lèi)信息注重了高劑量與低劑量并且COM與COD晶體在腎小管細(xì)胞中誘導(dǎo)性能性擾動(dòng)的差別效應(yīng)。研發(fā)結(jié)果還標(biāo)明，氧化應(yīng)激也許在用這類(lèi)不同劑量/型號(hào)的晶體解決的細(xì)胞的晶體結(jié)合本領(lǐng)中起首要功效[30]。

但是，理應(yīng)注重的是，COM / COD晶體的劑量及其表露于一切上述體外研發(fā)中運(yùn)用的細(xì)胞的時(shí)間也許并非完全代表結(jié)石成型劑中的體內(nèi)情況，這也許隨同著腎結(jié)石發(fā)病體制的另1個(gè)模型，即Randall的斑塊模型?，F(xiàn)在，晶體 - 細(xì)胞互相功效的體內(nèi)研發(fā)仿佛尚未用來(lái)腎結(jié)石研發(fā)，由于限定（實(shí)際上缺少）追蹤體內(nèi)晶體 - 細(xì)胞互相功效的技術(shù)。當(dāng)這類(lèi)技術(shù)可用時(shí)，腎結(jié)石生成的致病體制將愈加清楚。

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3. 腎小管細(xì)胞頂端外表COM晶體受體的蛋白質(zhì)組學(xué)判定

腎結(jié)石研發(fā)在細(xì)胞程度上獲得重要飛躍的另一步是開(kāi)發(fā)一類(lèi)簡(jiǎn)潔但有效的剝離方式來(lái)分離和純化極化腎小管細(xì)胞的頂膜[49]。這類(lèi)新方式首要依托于所加以的外表（比如，Whatman濾紙，硝酸纖維素膜，玻璃紙或玻璃蓋玻片）的吸附本領(lǐng)，以借用這類(lèi)外表和頂端膜之間的含水親和力和離子互相功效與頂端膜粘附。在測(cè)驗(yàn)的這4個(gè)外表中，濾紙是分離和純化頂端膜的最有效一類(lèi)，而基底外側(cè)膜蛋白沒(méi)有任意污染，這已通過(guò)免疫印跡和免疫熒光染色證明[49]。與傳統(tǒng)的生化測(cè)定（首要應(yīng)用基于離心的方式）相比，剝離方式在分離/純化頂端膜方面要有效得多。

該剝離方式用來(lái)分離極化腎小管細(xì)胞頂膜的高度純化部份，接著判定細(xì)胞外表的潛在COM晶體受體[32]。將回收的蛋白質(zhì)重懸于人工尿液中，并和COM晶體一塊孵育過(guò)夜。洗滌和洗脫后，凝膠加強(qiáng)液相色譜法，接著串聯(lián)MS（GeLC-MS / MS）共判定出96個(gè)潛在的COM晶體受體。此中，膜聯(lián)蛋白II成為COM晶體受體的功效通過(guò)晶體-細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，接著應(yīng)用特同性抗膜聯(lián)蛋白II抗體進(jìn)行中和[32]。另外，其余COM晶體受體也在隨后的研發(fā)中獲得證明，含蓋α烯醇化酶[34，36]、膜聯(lián)蛋白A1[33，35]、熱休克蛋白90（HSP90）[37，40]和質(zhì)膜Ca2+異肽酶 2 （PMCA2） [41]。

其余不成為COM晶體受體但其功效與各類(lèi)COM晶體受體有關(guān)的蛋白質(zhì)，含蓋α-微管蛋白和層粘連蛋白A / C.A-微管蛋白（一類(lèi)細(xì)胞骨架蛋白）被判定為應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方式用1000μg/mL COM晶體解決的腎小管細(xì)胞中的下調(diào)蛋白質(zhì)之一[25]，并成為蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)互相功效網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)[38]].α-微管蛋白的過(guò)表示造成3種COM晶體受體的下調(diào)，含蓋α烯醇化酶、熱休克蛋白70（HSP70）和HSP90，以及細(xì)胞的晶體結(jié)合本領(lǐng)下落[38]。相比之下，另一項(xiàng)蛋白質(zhì)組學(xué)研發(fā)發(fā)掘，層粘連蛋白A/C（一類(lèi)核層蛋白）是用100 μg/mL COM晶體解決的腎小管細(xì)胞中的上浮蛋白質(zhì)之一[24]，并成為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互相功效網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)[39]。小煩擾RNA（siRNA）敲低層粘連蛋白A/C造成4種COM晶體受體（含蓋維門(mén)汀、α烯醇化酶、S100和膜聯(lián)蛋白A2）的程度減低，以及細(xì)胞的晶體結(jié)合本領(lǐng)下落[39]。這類(lèi)信息標(biāo)明，層粘連蛋白A / C擁有各類(lèi)性能，含蓋調(diào)整其余蛋白質(zhì)的表示。對(duì)上述COM晶體受體及其調(diào)整劑或有關(guān)蛋白質(zhì)的表征也許造成進(jìn)一步成長(zhǎng)方略，通過(guò)阻斷COM晶體粘附在細(xì)胞上和晶體保留在腎內(nèi)來(lái)防范腎結(jié)石的生成。

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4. COM晶體對(duì)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的牽連

CaOx晶體不單與腎小管細(xì)胞互相功效，還與單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞互相功效，它們?cè)谶M(jìn)一步加劇腎結(jié)石生成的炎癥流程中起首要功效。因而，蛋白質(zhì)組研發(fā)已然研發(fā)了單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞呼應(yīng)COM晶體的功效。將人單核細(xì)胞U937細(xì)胞與100μg/mL COM晶體一塊孵育24小時(shí)，并檢驗(yàn)細(xì)胞蛋白質(zhì)組的改變[42]。應(yīng)用2-DE進(jìn)行深紫色熒光染色，接著進(jìn)行Q-TOF MS和MS/MS解析，結(jié)果顯現(xiàn)9種蛋白質(zhì)的程度上升，13種蛋白質(zhì)的程度減低，這類(lèi)蛋白質(zhì)在細(xì)胞周期、細(xì)胞構(gòu)造、碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、mRNA加工并且蛋白質(zhì)合成、安穩(wěn)和降解中的功效[42]。

起初，采取相似的方式研發(fā)人巨噬細(xì)胞與100μg/mL COM晶體互相功效24小時(shí)后細(xì)胞蛋白質(zhì)組的改變[43]。較為蛋白質(zhì)組解析揭露了7種上浮和7種下調(diào)蛋白質(zhì)，它們操控細(xì)胞構(gòu)造，碳水化合物代謝，DNA / RNA加工，蛋白質(zhì)代謝，分子運(yùn)輸和應(yīng)激反應(yīng)。有趣的是，蛋白-蛋白互相功效網(wǎng)絡(luò)解析標(biāo)明，HSP90直接與β肌動(dòng)蛋白和α微管蛋白互相功效，一切這類(lèi)互相功效的同伴在COM解決的巨噬細(xì)胞中都上浮。性能研發(fā)標(biāo)明，唯獨(dú)肌動(dòng)蛋白與HSP90共定位在被吞噬的COM晶體周邊，生成吞噬體構(gòu)造。siRNA對(duì)HSP90的敲低抑止了吞噬體的生成并且COM晶體誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的吞噬和遷移活性。這類(lèi)信息標(biāo)明，HSP90不單成為COM晶體受體，況且在巨噬細(xì)胞的吞噬體生成和吞噬活性中也起著至關(guān)首要的功效[43]。

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5. COM晶體對(duì)排泄組和外泌體蛋白質(zhì)組的牽連

除了COM晶體誘導(dǎo)的細(xì)胞蛋白質(zhì)組的變化外，還應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方式研發(fā)了晶體 - 細(xì)胞互相功效對(duì)排泄組的牽連。針對(duì)腎小管細(xì)胞，100 μg/mL COM晶體造成2種排泄蛋白程度上升，4種排泄蛋白程度減低[13]。有趣的是，應(yīng)用先前創(chuàng)建的基于纖溶酶原-纖溶酶活性的晶體遷移測(cè)定法進(jìn)行了性能研發(fā)[50]。信息顯現(xiàn)，排泄性烯醇化酶-1的加大反過(guò)來(lái)又通過(guò)ECM督促COM晶體侵蝕和單核細(xì)胞的遷移[13]。針對(duì)人單核細(xì)胞，用U937單核細(xì)胞孵育100μg/mL COM晶體16 h可誘導(dǎo)細(xì)胞中14個(gè)排泄蛋白加大和4個(gè)減小[44]。有趣的是，一項(xiàng)免疫熒光研發(fā)探測(cè)到細(xì)胞外表的HSP90加大，這標(biāo)明其加大的排泄也許來(lái)自非經(jīng)典排泄途徑[44]。

為了證明COM能夠通過(guò)非經(jīng)典排泄途徑誘導(dǎo)排泄組的改變，隨后的研發(fā)調(diào)研了來(lái)自人類(lèi)巨噬細(xì)胞的外泌體蛋白質(zhì)組的變化。應(yīng)用基于凝膠的[45]和無(wú)凝膠[46]定量蛋白質(zhì)組學(xué)方式，判定出不少顯著變化的外泌體蛋白。有趣的是，表露于COM晶體的巨噬細(xì)胞構(gòu)成更高程度的白細(xì)胞介素-1β（IL-1β），這是炎癥小體活化標(biāo)注物之一[51，52]。另外，來(lái)自這類(lèi)晶體互相功效巨噬細(xì)胞的外泌體誘導(dǎo)單核細(xì)胞的遷移/活化，單核細(xì)胞構(gòu)成更高程度的白細(xì)胞介素-8（IL-8）（一類(lèi)促炎細(xì)胞因子），其成為旁排泄激活巨噬細(xì)胞的吞噬活性[45]。siRNA敲低了一類(lèi)上浮蛋白（維門(mén)汀），順利地抑止了來(lái)自COM晶體表露巨噬細(xì)胞的外泌體的這類(lèi)功效[45]。另外，來(lái)自這類(lèi)晶體互相功效巨噬細(xì)胞的外泌體誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移，加強(qiáng)腎小管細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子IL-8的構(gòu)成，與COM晶體的結(jié)合本領(lǐng)更強(qiáng)，并通過(guò)ECM激活晶體入侵[46]。

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6. 論斷

在過(guò)去的12年中，蛋白質(zhì)組學(xué)已順利運(yùn)用于腎結(jié)石研發(fā)，旨在更好地了解腎結(jié)石生成的致病體制，特別是在晶體 - 細(xì)胞互相功效（表 1).這類(lèi)研發(fā)的第一階段首要牽扯與COM晶體互相功效后腎小管細(xì)胞中變化的全細(xì)胞蛋白質(zhì)組的表征。隨后，亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)揭露了細(xì)胞與COM晶體互相功效后線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)組改變和線(xiàn)粒體性能阻礙的其余數(shù)據(jù)。另外，對(duì)不同劑量和型號(hào)的CaOx晶體對(duì)腎小管細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的牽連的性能研發(fā)，促使更好地解讀受晶體 - 細(xì)胞互相功效牽連的腎小管細(xì)胞的表示和性能擾動(dòng)（見(jiàn)第2節(jié)）。在開(kāi)發(fā)出一類(lèi)簡(jiǎn)潔而高效的方式來(lái)從極化的腎小管細(xì)胞中純化頂膜以后，該行業(yè)產(chǎn)生了1個(gè)較大的飛躍。特別是，蛋白質(zhì)組學(xué)判定了批量潛在的COM晶體受體，接著在隨后的幾項(xiàng)研發(fā)中進(jìn)行了性能驗(yàn)證。這類(lèi)發(fā)掘針對(duì)進(jìn)一步制訂通過(guò)阻斷致病晶體與靶腎小管細(xì)胞之間的結(jié)合來(lái)防備腎結(jié)石生成的方略十分首要（見(jiàn)第3節(jié)）。除腎小管細(xì)胞外，蛋白質(zhì)組學(xué)還運(yùn)用于研發(fā)人單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞細(xì)胞蛋白質(zhì)組的改變，這類(lèi)改變?cè)斐筛逦亓私饨獬硴碜o(hù)內(nèi)化CaOx晶體和炎癥反應(yīng)的體制（見(jiàn)第4節(jié)）。另外，還開(kāi)發(fā)了幾種性能測(cè)定方式，以處理從蛋白質(zhì)組學(xué)研發(fā)的初始階段判定的表示信息的性能意思。比如，判定由COM晶體誘導(dǎo)的變化的排泄蛋白，這反過(guò)來(lái)又加重了通過(guò)ECM的晶體入侵。最終，較近對(duì)于巨噬細(xì)胞外泌體在腎結(jié)石生成炎癥級(jí)聯(lián)中的功效的常識(shí)供應(yīng)了額外的新數(shù)據(jù)，以更好地了解晶體 - 細(xì)胞互相功效時(shí)期的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)（見(jiàn)第5節(jié)）。綜上所述，一切這類(lèi)發(fā)掘都有助于更好地了解腎結(jié)石病的致病體制，特別是在晶體 - 細(xì)胞互相功效的方法中。另外，這類(lèi)發(fā)掘還也許造成開(kāi)發(fā)新的方略來(lái)防備新的和/或復(fù)發(fā)的腎結(jié)石的生成。